NIB

Osrednja tema mojega raziskovanja je razumevanje delovanja celic na molekularnem nivoju in integracija tega znanja na razumevanje delovanja organizmov. Vzporedno pa se ukvarjam tudi z razvojem metodologij, ki takšne raziskave omogočajo. Moje posebno veselje je interdiciplinarno delo, to je integracija bioloških znanj s statistiko, računalništvom in matematiko. Raziskovalni rezultati  so plod usklajenega delovanja multidisciplinarne raziskovalne skupine, ki jo vodim že skoraj dvajset let in v okviru katere posebno skrb posvečam tudi prenosu znanja na mlade raziskovalce in prenosu znanja v prakso. 

Naš eksperimentalni  model je krompir (Solanum tuberosum L.). Osredotočamo se predvsem na krompirjev virus Y (PVY) ter na koloradskega hrošča, ki povzročata veliko gospodarsko škodo. Poleg tega pa vključujemo v naše raziskave tudi okoljske neprilike kot so suša, vročina in poplave ter kombinacije le-teh. Naš glavni cilj je odkriti ključne komponente rastlinske imunosti, ki odločajo, ali bo izid stika občutljivost, bolezen, toleranca ali odpornost. Pri delu uporabljamo napredne metode kot so analiza odzivov skozi čas in prostor (single cell in spatial transcriptomics ) in  funkcionalna analiza genov za preverjanje njihove vloge. Združujemo  transkriptomske, metabolomske, hormonomske, proteomske pristope in fenotipiske podatke integriramo z različnimi orodji, kot na primer integracija z omrežji znanja (skm.nib.si), kar nam omogoča vizualizacijo presnovnih in signalnih poti.

 

 

Slika 1: eksperimentalni sistem – krompir, krompirjev virus Y (PVY), koloradski hrošč ter epi- in endofiti.

Razvili smo dve ključni orodji, ki skupaj omogočata celovit vpogled v to, kako rastline zaznavajo in obvladujejo stres. 

Stress Knowledge Map je interaktivna, javno dostopna baza znanja, ki združuje preverjene podatke o molekularnih odzivih rastlin na različne oblike stresa kot so suša, vročina, mraz, škodljivci in patogeni. Vsebuje natančen mehanistični model signalnih poti (PSS) ter obsežno mrežo vseh znanih molekularnih interakcij (CKN), kar raziskovalcem omogoča vizualizacijo povezav med geni, beljakovinami in metaboliti ter oblikovanje novih hipotez o odpornosti rastlin.

Omrežja znanja smo zelo uspešno uporabili pri integraciji multiomskih podatkov in s tem lahko spremljali dogajanja v listih krompirja, izpostavljenim težkim vremenskim pogojem: najprej vročini, zatem kombinaciji vročine in suše, ki jim je sledilo močno deževje s kratkotrajno poplavljenostjo. 

 

Slika 2: Integracija več-omskih podatkov v na znanju osnovano presnovno in signalno mrežo. A) Struktura mreže znanja. Posamezne preučevane komponente so obarvane glede na njihovo funkcijo v različnih poteh. B) Za primerjavo učinkov različnih stresov na celotno stanje rastline smo mreže znanja prekrili z izmerjenimi spremembami koncentracij komponent. Vozlišča so obarvana glede na log₂ spremembo izražanja (rdeče – povečanje pri stresu v primerjavi s kontrolo, modro – zmanjšanje pri stresu v primerjavi s kontrolo, sivo – meritev ni na voljo), prikazano za dva časovna trenutka: 8. in 14. dan vzorčenja pri različnih obravnavah s stresom. Prikazane omične meritve so bile pridobljene iz vzorcev listov. ABA – abscizinska kislina; Ca²⁺ – kalcij; ET – etilen; HSP – beljakovine toplotnega šoka; IAA – indol-3-ocetna kislina (avksin); JA – jasmonova kislina; Pro – prolin; PS – fotosinteza; ROS – reaktivne kisikove zvrsti; SA – salicilna kislina. Vir: Zagorščak in sod. 

Drugo orodje, potatoGEM, je računalniški model celotnega presnovnega sistema krompirja. Omogoča simulacije presnovnih sprememb v različnih okoljskih pogojih ali ob napadu bolezni in škodljivcev. S tem modelom je mogoče napovedovati, kateri encimi in poti so ključni za odpornost ali večji pridelek in tako usmerjati razvoj novih, trajnostno pridelanih sort.

Skupaj Stress Knowledge Map in potatoGEM tvorita močno raziskovalno platformo: prva ponuja celovit pregled signalnih poti in interakcij, druga pa omogoča poglobljeno simulacijo metabolnega odziva. Združeni omogočata razumevanje rastlinskih odzivov od trenutka zaznave nevarnosti do metabolnega odgovora, kar pospešuje razvoj odpornejših rastlin in trajnostnih rešitev v kmetijstvu.

V naših raziskavah smo odkrili, da rastline svoj imunski odziv na virusne okužbe uravnavajo izjemno prefinjeno – tako v prostoru kot v času. S pomočjo prostorske transkriptomike smo lahko natančno videli, kako se geni v okuženem tkivu in njegovi neposredni okolici izražajo v značilnih vzorcih. Posebej pomembno vlogo ima NADPH oksidaza RBOHD, ki oblikuje jasno mejo med okuženim in zdravim tkivom ter omogoča pravilno porazdelitev salicilne kisline, da virus ostane zamejen.

Slika 3: tridimenzionalni prikaz prostorskih odzivov na virusno okužbo.

Opazovanja sprememb redoks stanja v kloroplastih so razkrila, da se ob hipersenzitivnem odzivu signali ne širijo le v celicah, ki odmrejo, temveč tudi v oddaljenih “signalnih” celicah. Ti signali so del sistemskega obrambnega omrežja, ki rastlini omogoča hiter in usklajen odziv, pri čemer salicilna kislina ostaja ključna za ohranjanje signalne verige.

Slika 4: Genetsko kodirani senzorji so izjemna orodja za preučevanje odzivov rastlin na celični in subcelični ravni. V tem primeru smo uporabili senzor za določanje redoks stanja v kloroplastih – pt roGFP2. Legenda za relativno redoks stanje je prikazana na levi. Identificirali smo signalne celice z oksidiranimi kloroplasti (primeri na levi). Zanimivo je, da v celicah, ki obdajajo te celice, poteka intenzivna komunikacija med kloroplasti in jedri preko stromul (prikaz na sredini).

Lukan, T., Pompe Novak, M., Baebler, Š., Tušek-Žnidarič, M., Kladnik, A., Križnik, M., Blejec, A., Zagorščak, M., Stare, K., Dušak, B., Coll Rius, A., Pollmann, S., Morgiewicz, K., Hennig, J., & Gruden, K. (2020). Precision transcriptomics of viral foci reveals the spatial regulation of immune-signaling genes and identifies RBOHD as an important player in the incompatible interaction between potato virus Y and potato. The plant journal, 104(3), 645–661. https://doi.org/10.1111/tpj.14953
 

Prenos znanja v prakso

tehnološke rešitev za zaščito krompirja pred koloradskim hroščem, namreč s proteinski kompleksi, izoliranimi iz užitne gobe navadni ostrigar. V poljskem poskusu  brez insekticidov je pridelek naših rastlin več kot 2x višji kot pri kontrolnih rastlinah.

Za ta izum so avtorji oddali tudi patentno prijavo in ustanovili podjetje Pestevene za učinkovitejši prenos znanja v industrijsko uporabo in za izum prejeli nagrado Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani v letu 2024.

Slika 5: poškodbe rastlin krompirja po napadu koloradskega hrošča. Rastline zaščitene s proteini iz ostrigarja (na levi) in kontrolne rastline brez proteinov.