Projekti

Povzetek

Glioblastoma multiformae (GBM) je eden najbolj smrtnih oblik raka z mediano preživetja okrog 12 mesecev. Novejše teorije nastanka raka opisujejo nastanek malignega tkiva iz tumor inicirajoče celice, ki ima lastnosti podobne matičnim celicam – to je glioblastomske matične celice (GMC). Selektivno ciljno uničenje teh celic, z uporabo infiltrirajočih mezenhimskih matičnih celic (MMC), predstavlja nov možni način zdravljenja GBM.   Del A: Proteom GMC – PM povezani proteinski označevalci Za raziskovalno in klinično uporabo nujno potrebujemo nove proteinske označevalce celic GMC s katerimi bo mogoče ločiti med celicami GMC in normalnimi nevralnimi matičnimi celicami (NMC). Ti označevalci bodo uporabni za diagnozo in prognozo preživetja pacientov, hkrati pa bodo lahko služili kot tarče za bolj učinkovito terapijo. Ker zanesljivi označevalci še niso znani, predlagamo uporabo proteomike na izoliranih proteinih iz plazemske membrane (PM) za določitev prstnega odtisa GMC. Natančneje: 1. Naš namen je razkriti PM-proteom z metodo proteomike geLC-MS v sferoidih GBM (tumorosferah), izoliranih iz humanih GBM biopsij, ki so močno obogatene z GMC in jih primerjati s sferoidi NMC (nevrosferami). Testirani sferoidi bodo gojeni v gojišču s serumom in brez seruma. 2.  Izraženi proteini tumorosfer, ki se bodo statistično značilno različno izražali v nevrosferah bodo nato validirani na tkivnih mikromrežah (TMA), sestavljenih iz GBM vzorcev bolnikov. S tem bo določena diagnostična in napovedna vrednost novih označevalcev. Najbolj relevantni označevalci bodo testirani s funcijskimi testi in vitro in in vivo.   Del B: Fenotipska karakterizacija GMC Glavna značilnost GBM tumorjev je njihov infiltrativen tip invazije v okoliško tkivo. Predpostavlja se, da je migratorni fenotip GMC povezan z epitelno-mezenhimsko-preobrazbo (EMP), ki je sicer značilna za epitelijske tumorje. Predvidevamo, da do podobne reverzibilne preobrazbe iz stacionarnega v migratoren (invaziven) fenotip prihaja tudi pri celicah GMC in te spremembe želimo identificirati na ravni transkriptoma-degradoma in jih primerjati s PM-proteomom GMC. Natančneje: 1. Naš namen je primerjati transkriptom tumorosfer GMC s transkriptomom visoko migratornih nevrosfer NMC. »Mirujoč« transkriptom celic bomo primerjali z njihovim »aktiviranim migratornim« transkriptomom (migratomom) po stimulaciji EMP z (a) dodatkom seruma in (b) izpostavitvijo hipoksičnim pogojem, ki vladajov tkivnih nišah GMC. 2. Poseben poudarek bo na migratomu GMC, ki je povezan z degradomom (proteazami), z namenom odkriti signalne poti, ki povezujejo izražanje proteaz s procesom EMP. 3. Novi označevalci GMC (GMC-specifični & EMP-ključni) bodo validirani in funkcijsko potrjeni z utišanjem/izničenjem in biološko/kemično inaktivacijo v invazijskih testih. Posebna pozornost bo namenjena primerjavi s profilom PM-proteaz dobljenih pri analizi PM proteoma GMC(Del A).   Del C: Mikrookolje GMC– infiltracija z MMC Tumorsko mikrookolje vpliva na EMP/MEP. V mikrookolju GBM najdemo tudi MMC (gbMMC), ki lahko vplivajo na GMC. Interakcije med (KM)MMC iz kostnega mozga, gbMMC in GSC bomo analizirali in vitro in in vivo v živalskem modelu. Naš cilj je odkriti transkriptomski, metabolni in parakrini odziv ko-kultiviranih celic in vitro.

 

Pomen za razvoj znanosti

Pomemben nov znanstveni pristop v okviru tega projekta je, da povezuje raziskave tumorske biologije in raziskave matičnih celic s sistemsko biologijo. Z analizo izražanja genov, proteinov in regulatornih molekul  ob  različnih in vitro ustvarjenih pogojih, ki so podobni pogojem v samem tumorju in vivo, bomo bolje razumeli lastnosti glioblastomskih (GBM) celic v primerjavi z normalnimi neuralnimi celicami. Ustrezna izbira eksperimentalnega pristopa in metod  bo povezala laboratorijske raziskave na kliničnem materialu (podatki iz t.i. ‘mokrega’ laboratorijskega dela) z bioinformatiko (‘suhi laboratorij’), ki s svojimi orodji in pristopi iz velikega števila podatkov izbere relevantne rezultate, ki so ključni za razumevanje celičnih procesov, ki jih proučujemo. Proteomski pristop bomo uporabili pri določanju diferencialno izraženih proteinov na površini (plazemski membrani) GMC, ki jih bomo primerjali z neuralnimi matičnimi celicami. S tem pristopom bodo odkriti povsem novi proteini, ki bodo bolj selektivno označevali tumorske matične celice  od doslej poznanih. Ti novi  označevalci utegnejo vplivati na napoved preživetja in občutljivosti na zdravljenje obenem pa so lahko tudi nove tarče za razvoj bolj učinkovitih zdravil.  S sledenjem izražanju genov,  proteinov, ter njihovih regulatornih molekul (citokinov, mikroRNA) in metabolnega stanja samih GBM matičnih celic v različnem okolju, (kot je npr. pomanjkanje kisika -hipoksija), bo razkrita njihova spremenljiva invazivnost, ki je ključna za širjenje teh tumorjev v normalno možganovino. Identifikacija genov in proteinov/proteaz, ki se pri reverzibilnem prehodu iz stacionarnega v migratorno stanje (EMP preobrazba) aktivirajo pri GMC, je ključnega pomena za razumevanje in inhibicijo njihovih invazivnih lastnosti. Prav tako ni zano, kako mezenhimske matične celice, ki se infiltrirajo v GBM  iz kostnega mozga (KM-MMC), kjer postanejo del tumorskega mikrookolja (gbMMC) vplivajo na obnašanje tumorskih oz. GBM matičnih celic. Z enakim sistemskim pristopom kot omenjeno zgoraj, zato nameravamo slediti tudi interakcijam GMC in MMC celic preko analize sproščanja regulatornih molekul (citokini in miRNA), v direktnih in indirektnih ko-kulturah celic GMC in MMC in razkriti njihovo interakcijo. Poznanih je več nasportujočij modelov nastanka raka, ki vključujejo matične celice GMC. S predlaganim eksperimentalnim pristopom bomo morda lahko postavili tudi novo hipotezo iniciacije in invazivnega napredovanja GBM, ki je najbrž posledica delovanja matičnih celic.  Na predlagani izvirni način bomo odkrili relevantne skupine molekul in nove signalne poti pomembne za razvoj in napredovanje GBM, ki ga pogojujejo GMC in njihove interakcije s spreminjajočim se okoljem (hipoksijo) in mezenhimske matične celice, ki so se sposobne infiltrirati v tumor. V povzetku, predlagani projekt napoveduje odkritje novih bioloških označevlcev tumorskih matičnih celic (GMC), pomembnih za uporabo  v klinični onkologiji kot tarče za zdravljenje GBM.