Projekti

Povzetek

Izhodišče in predstavitev problema. S povečanim znanjem o človeškem genomu in tehnološkim napredkom na področju molekularne biologije hitro napreduje tudi razvoj genske terapije, vključno z gensko terapijo raka in razvojem DNA cepiv. Eden izmed glavnih ciljev raziskovalcev genske terapije ali DNA cepiv je razvoj varnega in učinkovitega sistema za prenos genov v tarčne celice. To namreč še vedno predstavlja eno od glavnih ovir v razvoju različnih pristopov genske terapije in je ključen dejavnik za uspešnost terapije. Drugi dejavniki, ki jih je potrebno upoštevati pri razvoju genske terapije, so izbira ustreznega terapevtskega gena, regulacija njegovega izražanja in način vnosa. V predlaganem projektu bomo preučevali dva izmed teh dejavnikov. To sta varnost plazmidne DNA s pripravo plazmidne DNA brez rezistence na antibiotik in regulacija izražanja terapevtskega gena s povezavo terapevtskega gena na celične promotorje z namenom doseči gena z indukcijo stresa ali fiziološko regulacijo izražanja. Poleg tega bomo določevali tudi možnost horizontalnega genskega prenosa med rekombinantnimi plazmidi, trangenimi bakterijami in bakterijami naravno prisotnimi v organizmu. Naša hipoteza je, da so plazmidi, ki kodirajo terapevtske gene pod kontrolo tkivno specifičnih in inducibilnih promoterjev ter so brez gena za antibiotično rezistenco, varni vektorji z reguliranim izražanjem za uporabo v genski terapiji Metode dela. Plazmidi, ki kodirajo za reporterske ali terapevtske protein pod kontrolo tkivno specifičnih in inducibilnih promoterjev bodo pripravljeni s standardnimi molekularno biološkimi metodami in po navodilih proizvajalca plazmida ORT. S to tehnologijo bomo proizvedli namreč plazmide brez gena za antibiotično rezistenco. Primerne bakterijske seve bomo transformirali s pripravljenimi plazmidi in proizvedli večje količine plazmidnih DNA brez endotoksina, ki jih bomo uporabili v nadaljnjih poskusih. Horizontalni genski prenos bomo določali s PCR testom in ostalimi standardnimi laboratorijskimi postopki, tudi za pripravo biofilmov. Učinek pripravljenih plazmidov na delovanje različnih celičnih kultur bom spremljali s testom proliferacije, antiagiogeneze in testom za določevanje metastatskega potenciala. Na tumorskih modelih in vivo bomo določili protitumorsko delovanje pripravljenih plazmidov, ter opavili histološko analizo tumorjev. Protitumorsko delovanje bomo določali s testom zaostanka v rasti ter testom lokalne kontroli rasti tumorjev. Izvajanje projekta. Projekt se bo izvajal v laboratorijih pri vseh 5 sodelujočih partnerjih, kjer je za izvajanje eksperimentalnega dela zagotovljena vsa raziskovalna oprema za molekularno biološke tehnike, za celične kulture, za imunocitokemične preiskave in testiranje protitumorskega učinka na tumorskih modelih. Raziskovalci na projektu imajo bogate izkušnje na področju priprave plazmidov, uporabe elektroporacije za vnos različnih molekul v celice in tkiva, kot so citotoksična zdravila in nukleinske kisline, ter radiobiologije. Vodenje in koordinacija projekta se bo izvajala z neposrednimi kontakti z udeleženci na projektu in rednimi delovnimi sestanki. Relevanca in potencialni vpliv rezultatov. Predlagan projekt je zasnovan kot predklinični projekt, ki obravnava pomembne teme na področju varne uporabe genske terapije v kliničnih okoljih. Rezultati projekta, če bo uspešen, lahko imajo vpliv na planiranje in izvajanje kliničnih študij genske terapije ne samo v Sloveniji, ampak tudi širše.

Pomen za razvoj znanosti

Genska terapija pridobiva z razvojem novih, varnih metod genskega vnosa, vedno večjo veljavo.  Vendar pa je še vedno eden od primarnih ciljev raziskovalcev na področje genske terapije razvoj učinkovitega in varnega sistema za transfekcijo/transdukcijo tarčnih celic. Idealna metoda genskega  prenosa bi dovoljevala vnos dovolj velike koncentracije DNA v želene tarčne celice z minimalnimi neželenimi stranskimi pojavi. Elektroporacija, kot način vnosa plazmidne DNA, se je pokazal kot dobra alternativa virusnim načinom vnosa. V veterinarski onkologiji je na tržišču že prva vakcina za zdravljenje pasjega melanoma, ki temelji na vnosu z elektroporacijo. Vendar pa je za širšo uporabo elektroporacije v kliničnih protokolih potrebno dodatno izboljšati plazmidne DNA predvsem iz vidika varnosti. Elektroporacija je med nevirusnimi načini ena od najbolj uveljavljenih metod, saj so v teku že klinične študije tako na področju raka, kot tudi na področju DNA vakcin, te predvsem v veterinarski medicini. Naša raziskovalna skupina je ena od pionirjev na tem področju, saj se z elektroporacijo raziskovalno ukvarjamo že 20 let, specifično z elektrogenskim prenosom pa od leta 1999. Predlagane raziskave bodo nadaljevanje našega dela. V predhodnih raziskavah smo delali predvsem na optimizaciji pogojev elektrogenskega prenosa, tako v tumorje, kot tudi v mišice. Naša skupina je edina dosedaj pokazala kako vpliva zgradba različnih tumorjev na uspešnost transfekcije in s tem pokazala, da je možno napovedati deloma tudi terapevtski uspeh določene elektrogenske terapije. Z raziskavami na elektrogenskem prenosu v mišico, pa smo pokazali, da se da s primerno izbiro parametrov električnih pulzov, dozo plazmidne DNA in časovnim intervalom injiciranja DNA, kontrolirati tako nivo izražanja transgena, kot tudi čas ekspresije transgena. Predkratkim smo dokazali, da je elektroporacija tudi primerna metoda za transfekcijo kratkih interferenčnih RNA molekul (siRNA) v tarčne celice in pokazali, da imata siRNA molekuli proti CD105 in CD146 antiangiogene in antiporliferacijske učinke na endotelijske in melanomske celice v in vitro pogojih. Nadalje smo dokazali, da imata lokalna in sistemska elektrogenska terapija z IL-12 izrazit protitumorski učinek na sarkomske tumorje tudi v kombinaciji z radioterapijo. Predlagane študije so posvečene temeljnim skrbem, povezanim z varnostjo uporabe plazmidne DNA za zdravljenje. Sestava projektne skupine na osnovi strokovnega znanja posameznih partnerjev zagotavlja, da bomo v predlaganem projektu uspešno pripravili terapevtske plazmide brez antibiotične rezistence, ki bodo imeli velik potencial za uporabo v kliničnih študijah. Študije, ki jih bomo izvedli na področju horizontalnega genskega prenosa pa bodo dodatno doprinesle k natančnejšemu ocenjevanju tveganja za izvajanje kliničnih študij s trenutno dostopnimi plazmidnimi DNA ter bodo v pomoč tudi različnim državnim inštitucijam pri podeljevanju dovoljenj za izvajanje kliničnih študij.