Projekti

Trenutno veljavna zakonodaja zahteva testiranje genotoksičnosti za vse novo razvite kemikalije in produkte kot so zdravila, kozmetika, zdravila, kozmetični pripravki, prehranski in krmni dodatki, pesticidi ipd. Smernice, ki urejajo testiranje genotoksičnosti predvidevajo, da se to začne s setom in vitro testiranj na bakterijah in sesalčjih celicah, čemur v primeru pozitivnih rezultatov nujno sledijo še poskusi na glodavcih. V skladu s predlagano strategijo Referenčnega laboratorija Evropske unije za alternative poskusom na živalih (EURL ECVAM) je "Preprečevanje in zmanjševanje uporabe živali v genotoksikologiji" mogoče doseči z razvojem bolj zanesljivih in vitro testov, ki bi jim sledilo manj in vivo preverjanj, kar je namen predlaganega projekta. Ocenjuje se namreč, da je trenutno 80% vseh izvedenih in vivo testiranj genotoksičnosti v EU posledica lažnih pozitivnih rezultatov in vitro testiranj, in bi se jim lahko izognili z bolj zanesljivimi testi. Pomemben razlog za lažne pozitivne rezultate v obstoječih in vitro testih je ta, da sesalčje celične linije, ki so na voljo, ne izražajo vseh metabolnih encimov I. in II. stopnje, ki v živih organizmih katalizirajo metabolno aktivacijo in detoksifikacijo genotoksinov. Namen opisanega projekta je razvoj humanih jetrnih celic, v katerih bodo aktivni encimi I. in II. faze metabolizma, ki bodo v primerjavi z znanimi celičnimi linijami bolje odražale biotransformacijo in genotoksično delovanje kemikalij v organizmu. Za nekatere celične linije človeškega izvora je bilo v preteklosti že pokazano, da se je v njih ohranila aktivnost nekaterih encimov, ki sodelujejo pri presnovi zdravil, a zaradi nestabilnosti in manjkajočih pomembnih encimov niso primerne rutinske teste. V okviru predlaganega projekta bomo opravili primarni presejalni preizkus nabora obstoječih jetrnih celičnih linij, ki izvirajo iz celic človeškega hepatoma, iz matičnih celic ali iz imortaliziranih primarnih jetrnih celic. Na ta način bomo prepoznali najobetavnejše celične linije, ki izražajo metabolne encime I. in II. stopnje in omogočajo zaznavo genotoksičnih učinkov znanih genotoksičnih rakotvornih snovi različnih skupin. V izbranih celičnih linijah bomo preučili transkripcijo jetrno specifičnih transkripcijskih faktorjev (LETF), ki regulirajo transkripcijo encimov za metabolizem kemikalij, njihovo aktivnost in izražanje proteinov ter jih primerjali s primarnimi človeškimi hepatocitami. V nadaljevanju bomo izboljšali občutljivost izbranih celic za zaznavanje genotoksičnih učinkov kemikalij z uporabo novega pristopa, ki temelji na ponovni aktivaciji izražanja ključnih encimov za metabolizem kemikalij s transfekcijo ekspresijskih vektorjev z geni za ključne LETF, ki regulirajo njihovo izražanje. V zadnji fazi projekta bomo za najprimernejšo novo celično linijo izdelali protokol za test mikrojeder. Protokol bomo validirali preko testiranj kemikalij s seznama, ki ga je v ta namen sestavila skupina strokovnjakov v ECVAM, ki se ukvarja z z validacijo novih in vitro testov genotoksičnosti. Pričakujemo, da bo z novo celično linijo moč doseči zanesljivejše (tj. manj lažnih pozitivnih) rezultate testov genotoksičnosti. S tem bomo pomembno prispevali k zmanjšanju potreb po uporabi glodavcev v rutinskih testiranjih genotoksičnosti in k povečanju zanesljivosti ocen tveganja pri razvoju novih kemikalij in produktov, kar je ključno za varovanje zdravja ljudi. Poleg tega bo nova celična linija koristna za študije akutne toksičnosti ter za farmakološke raziskave metabolizma zdravil. Inovativen in ambiciozen projekt bo realiziran v okviru sodelovanja Slovenskih znanstvenikov z Nacionalnega inštituta za biologijo in Onkološkega inštituta Ljubljana z Avstrijskimi znanstveniki z Medicinske univerze na Dunaju saj se njihovo strokovno znanje in izkušnje s področja genetske toksikologije, molekularne biologije, biologije matičnih celic naprednih »omskih« tehnologij dopolnjujejo.

V 21. stoletju poteka hiter proces prehoda od in vivo testov na živalih k in vitro metodam. Vendar pa imajo modelne celice, ki so trenutno na voljo za in vitro toksikološke raziskave na splošno in za teste genotoksičnosti, številne omejitve, pri čemer so najpomembnejše vezane na zmanjšano zastopanost encimov metabolizma ksenobiotikov. Potrebo po premostitvi tega problema poudarjajo številni znanstveniki. Ravno to pa je glavni cilj našega projekta. V predlaganem projektu bomo ne bomo le razvili metabolno aktivnih jetrnih celic, pač pa bomo s toksikogenomskim pristopom tudi razjasnili biokemijske procese in poti, ki niso dovolj izražene in predstavljajo omejitev uporabnosti in vitro testnih modelov.Nova znanja bodo zelo pomembna tako za prihodnji razvoj in vitro testnih modelov, kot tudi za boljše razumevanje in razlago toksikoloških rezultatov, kar je pomembno za zakonodajno toksikologijo. Poseben znanstveni doprinos bo imel naš pristop k razvoju stabilnih metabolno aktivnih jetrnih celic preko diferenciacije matičnih celic, ki bo, če bo uspešen, pomenil pomemben preboj ne samo pri testiranju genotoksičnosti, temveč v toksikologiji in farmakologiji na sploh. Ne nazadnje bo imela nova metabolno aktivna celična linija potencial za mnoge aplikacije, ne le v rutinskem testiranju, pač pa tudi v študijah biokemijskih mehanizmov toksičnosti, posebno za študij in ovrednotenje nevarnosti, ki jih predstavlja izpostavljenost mešanicam onesnaževal, kar je trenutno eno izmed najbolj vročih znanstvenih vprašanj v toksikologiji in pri ocenjevanju tveganja za zdravje ljudi in okolja