Sistemska biologija

Metodološki pristopi

Sistemska biologija biološke probleme obravnava celostno. Sem se uspešno vključuje transkriptomika z metodami DNA mikromrež in kvantitativnim PCR v realnem času. V skupini te metode uporabljamo za proučevanje procesov na najrazličnejših področjih. Rezultate, pridobljene z metodami transkriptomike dopolnjujemo še na nivoju proteomskih analiz (2D-PAGE v povezavi z masno spektrometrijo in analizo aktivnosti proteinov). V sodelovanju z Inštitutom Max- Planck za kemično ekologijo (dr. Axel Mithoefer, Jena, Nemčija) uvajamo tudi analizo hlapih snovi, ki jih sproščajo rastline v komunikaciji z okoljem. Natančnejše študije izražanja genov v specializiranih celicah pa proučujemo z metodami in-situ hibridizacije v sodelovanju z Biotehniško fakulteto (prof. dr. Marina Dermastia).

V okviru biokemijskih in citoloških raziskav proučujemo vpletenost rastlinskih rastnih regulatorjev (citokinini, jasmonska in salicilna kislina), kisikovih radikalov, fotosintetskih pigmentov in nekaterih proteinov v obrambni odziv rastlin.

Vse metodologije, ki predstavljajo elemente sistemskega pristopa, so tesno povezane s pridobivanjem velike količine podatkov, kar predstavlja izziv ne samo za biologe ampak tudi za statistike in bioinformatike. Kompleksna analiza podatkov je bila tako pogosto povezana s številnimi napačnimi zaključki in posledično z nezaupanjem v uporabljene metode. Zato je potrebno biološke probleme pogledati tako z zornega kota biologov kot z zornega kota biostatistikov in bioinformatikov, in sicer pri načrtovanju poskusov, analizi poskusov, interpretaciji rezultatov ter shranjevanju podatkov.

Na Oddelku razvijamo in uporabljamo statistične metode kot so analiza variance in multivariatna analiza, predvsem metoda glavnih komponent ter diskriminantna analiza. Poleg statističnih metod uporabljamo tudi metode podatkovnega rudarjenja, to so odločitvena drevesa ter vpeljujemo nove algoritme primerne za obravnavo bioloških problemov, s katerimi se ukvarjamo na Oddelku. Še posebej smo se usmerili v analizo podatkov mikromrež (Slika 1), ki vključuje kontrolo kakovosti podatkov (Slika 2 in Slika 3), predprocesiranje podatkov, statistično obdelavo podatkov in vizualizacijo rezultatov – vpetost v biološki kontekst.

Mehanizmi interakcije med gostiteljem in patogenom

Interakcija krompir – virus PVY



Slika 1: Virus PVYNTN (levo) in bolezenska znamenja na krompirjevih gomoljih ter listih.
Slika 2: Zdrav (levo) in z virusom PVYNTN okužen krompir sorte Igor.

Mehanizem odziva rastlin na okužbo proučujemo pri rastlinah krompirja (Solanum tuberosum L.), ki so okužene s krompirjevim virusom Y (PVY), ki povzroča bolezen imenovano prstanasta nekroza gomoljev krompirja. Epidemija te bolezni je od leta 1988 dalje znatno vplivala na pridelovanje osnovnega in komercialnega krompirja v Sloveniji. Zunanji znaki bolezni so dobro poznani (Slika 4 in Slika 5), medtem ko je mehanizem okužbe slabo raziskan. Odziv rastlin na virusno okužbo proučujemo na biokemijskem, citološkem in molekularnem nivoju. Pri tem smo v raziskave vključili različno agresivne različke virusa, PVYN in PVYNTN, ter različno odporne sorte krompirja. S hibridizacijami DNA mikromrež spremljamo odgovor zelo občutljive sorte Igor na okužbo s PVYNTN in ga primerjamo z odgovori različno odpornih sort, npr sorte Sante, ki ima z metodami klasičnega žlahtnjenja vnesen rezistenčni gen Rysto iz divjega sorodnika krompirja Solanum stoloniferum. Spremembe v izražanju izbranih genov za bolj specifične potrebe pa spremljamo z metodo PCR v realnem času.

Jasmonska (JA) in salicilna (SA) kislina sta pomembni obveščevalni molekuli pri odzivu rastlin na okužbo. Rezultati kažejo, da je JA udeležena v zgodnjem odzivu krompirja na virusno okužbo, predvsem pri odporni sorti Sante. Vloga SA pri odpornosti krompirja je manj jasna. Okužba povzroča tudi inaktivacijo (glikozilacija) aktivnih oblik citokininov v koreninah občutljive sorte krompirja, medtem ko pri odporni sorti tega procesa ne zasledimo. Proučili smo tudi vpliv virusne okužbe na peroksidaze in metabolizem fotosintetskih pigmentov, saj so poškodbe tkiva pogosto povezane z razgradnjo klorofilov, pri kateri sodelujejo tudi peroksidaze. Pokazalo se je, da se procesi propadanja listov pri okuženih rastlinah razlikujejo od procesov, ki so posledica naravnega staranja. Virusna okužba vpliva tudi na ultrastrukturo kloroplastov.

Eden od zgodnjih odzivov rastlin na abiotski in biotski stres je sproščanje reaktivnih kisikovih spojin, med katere uvrščamo tudi vodikov peroksid. Spremembe v količini vodikovega peroksida po okužbi krompirja s PVYNTN merimo z luminiscenčno metodo.


Interakcija vinska trta – fitoplazme

Raziskujemo tudi interakcijo med fitoplazmami in vinsko trto, pri čemer smo se osredotočili na zlato trsno rumenico (Flavescence dorée) in fitoplazmo počrnelosti lesa (Bois noir). Interakcije fitoplazem z rastlinami je izredno težko raziskovati zaradi njihove neenakomerne razporeditve v rastlini, popolne odvisnosti od gostiteljske celice (ni jih mogoče samostojno gojiti) ter težavnega prenosa iz rastline na rastlino preko insektnih vektorjev. Pri interakciji preučujemo odziv vinske trte na okužbo s fitoplazmami na nivoju izražanja genov. Glavni raziskovalni metodi sta PCR v realnem času in oligonukleotidni DNA mikromrežami. Raziskave potekajo na vinski trti iz vinogradov. S tem želimo prispevati k razumevanju patogeneze trsnih rumenic v v njihovem naravnem ekosistemu (link projekt fitoplazme, vodja Kristina Gruden). V okviru teh raziskav sodelujemo z projektom italijanskega ministrstva GIAVI, kjer smo partnerji Univerze v Udinah (prof. Ruggero Ossler) in v COST858 projektu VITICULTURE: Biotic and abiotic stress - Grapevine defence mechanism and grape development.

Interakcije z več povzročitelji stresa

Rastline začnejo ob napadu žuželčjih škodljivcev proizvajati številne obrambne snovi, ki zmanjšajo hitrost rasti in povečajo umrljivost žuželk. Take snovi so npr. inhibitorji encimov in polifenol oksidaze. Ob zaužitju takih snovi, se v žuželkah poveča sinteza že obstoječih prebavnih encimov in v nekaterih primerih sinteza prebavnih encimov, ki niso občutljivi na inhibitorje. Cilj naših raziskav je razumeti molekulske interakcije med krompirjem in koloradskim hroščem in določiti ključne gene in proteine, ki omogočajo koloradskemu hrošču, da se prilagodi rastlinski obrambi in se normalno razvija na krompirju.

Ker poljščine sočasno lahko napadajo rastlinojedi in patogeni mikroorganizmi, raziskujemo tripartitno interakcijo med krompirjem, koloradskim hroščem in virusom PVY. Gensko izražanje v krompirjevih listih in prebavilu ličink koloradskega hrošča proučujemo z RNAseq. Sproščanje hlapnih snovi iz krompirja analiziramo z metabolomskim pristopom z uporabo CG-MS. Pokazali smo že, da je aktiviran odgovor občutljivih rastlin krompirja na okužbo s PVY uravnotežen z obrambo pred rastlinojedci. Virusna okužba naredi rastline ranljivejše pri sledečih napadih koloradskega hrošča. Hrošč in virus vplivata na sproščanje hlapnih snovi iz krompirja , kar deluje na sosednje rastline krompirja ali učinkuje na obnašanje in odgovore drugih povezanih organizmov v okolju. Tako ima lahko kombinacija različnih biotičnih stresorjev širše agro-ekološke posledice.

Figure 3: Colorado potato beetle (CPB)
Slika 3: Koloradski hrošč

Razvoj metodologij sistemske biologije

Slika 4: Shematska predstavitev pristopov.


Zajem podatkov

Sistemska biologija obravnava biološke problem celovito. V naše raziskave je z metodami sekvenciranja nove generacije, mikročipov DNA in kvantitativne PCR v realnem času uspešno vključena transkriptomika. Te metode uporabljamo za študij procesov v različnih bioloških sistemih. Rezultate pridobljene na transkriptomski ravni dopolnjujemo s proteomskimi rezultati, pridobljenimi z 2D-PAGE, povezano z masno spektrometrijo, hitro MS in MRM ter analizo encimskih aktivnosti (tesno sodelovanje s prof. Weckwertom z Univerze na Dunaju). V povezavi z inštitutom Max Planck za kemijsko ekologijo iz Jene (dr. Axel Mithoefer) smo uvedli analizo hlapnih spojin, ki jih rastline sproščajo pri komuniciranju z okoljem. Biokemične in citološke raziskave vključujejo rastlinske rastne regulatorje (citokinine, jasmonsko in salicilno kislino), kisikove radikale, fotosintezne pigmente in nekatere proteine obrambnega odgovora rastlin.


Analiza podatkov in interpretacija

Vse metodologije, povezane s pristopi sistemske biologije so tesno povezane z zajemanjem velikih količin podatkov. To je izziv ne le za biologe, temveč tudi statistike in bioinformatike. Tako je za ustrezen končni rezultat potrebno natančno načrtovanje poskusov.

Za odgovore na biološka vprašanja razvijamo statistične modele (regresijski in linearni modeli) in uvajamo pristope multivariatne analize (analiza glavnih komponent in diskriminantna analiza). Poleg statističnih metod med drugimi uvajamo tudi metode podatkovnega rudarjenja in odločitvena drevesa. Kadar je to potrebno, razvijamo tudi nove algoritme in sisteme za upravljanje delovnih postopkov, ki so primerni za določena biološka vprašanja in hipoteze. Še posebej se usmerjamo k analizi transkriptomskih podatkov, ki vključuje nadzor kakovosti podatkov, predprocesiranje podatkov, statistično analizo podatkov in vizualizacijo rezultatov.


Interpretacija rezultatov in razvoj orodij

Za integarcijo podatkov v biološki kontekst se poslužujemo združevanja predhodnih znanj z eksperimentalnimi podatki. To dosegamo z razvojem orodij, ki omogočajo meta analize velikih količin podatkov ali pripravo podatkov za drugo javno dostopno programsko opremo. Na osnovi ontologije MapMan smo razvili aplikacijo GoMapMan application (www.gomapman.org). Ta povezuje ontološke funkcionalne deskriptorje z ortolognimi informacijami, kar omogoča lažji prenos med modelnim organizmom navadnim repnjakovec (Arabidopsis thaliana) in različnimi poljščinami. Poleg organiziranja genov in njihovih pripisanih ontologij, GoMapMan omogoča tudi vnos dokumentov iz drugih programov, kot sta Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) ali MapMan tool. V sorodnem projektu plantSEGMINE smo v sodelovanju z Inštitutom Jožef Stefan razvili orodje za pomoč pri ustvarjanju in izmenjavi sistemov za upravljanje analize podatkov.


Modeliranje

Kot predhodno stopnjo biološkega modeliranja in napovedovanja smo že razvili strukturni model rastlinskega imunskega signaliziranja. Model vključuje signalne komponente treh pomembnih rastnih regulatorjev rastlinske obrambe: jasmonske kisline, salicilne kisline in etilena. Na povezavi je interaktivni model. Trenutno izpopolnjujemo model z javno dostopnimi spoznanji npr. o interakcijah protein-protein ter transkripcijskih in miRNA uravnalnih omrežjih. Končni cilj zgrajenega omrežja je zadostitev izvorni paradigmi sistemske biologije z možnostjo dinamičnega modeliranja in ustvarjanja novih hipotez.

Abscizija pri paradižniku

Abscizija je natančno časovno in prostorsko uravnavan proces, v katerem se različni organi, vključno z listi, cvetovi ali plodovi ločijo od matične rastline. Osnova za abscizijo organov je proces ločevanja celic, do katerega specifično prihaja v tkivu predoblikovanega abscizinskega območja (AZ) na bazi organa, ki bo odpadel. Abscizinsko območje se morfološko in fiziološko razlikuje od sosednjih celic. Vključuje manjše, citoplazemsko goste celice, ki oblikujejo od 1 – 50 celičnih plasti v različnih rastlinah. Pokazali smo že, da se z abscizijo povezani procesi pri paradižniku pojavljajo asimetrično med proksimalnim in distalnim delom AZ. Odkrili smo, da je programirana celična smrt ključni mehanizem, ki se asimetrično pojavlja med normalnim potekom abscizije. Rezultati nakazujejo pommebno vlogo LX v procesu programirane celične smrti. V potekajoči študiji na transkriptomski, strukturni in ultarstrukturni ravni raziskujemo različne encime, ki imajo domnevno vlogo pri listni in cvetni absciziji paradižnika.